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CLA对HepG2细胞脂肪堆积的影响
【摘要】目的 研究共轭亚油酸对HepG2细胞中脂质沉积的影响。方法 以HepG2细胞为研究对象，以不同浓度CLA（10μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用细胞24小时，采用油红染色、RT-PCR等方法检测肝脏脂肪沉积、ACC mRNA表达，观察CLA对肝细胞内脂质沉积的影响。结果 CLA增加HepG2细胞中脂质沉积，50μmol·L-1CLA组细胞中红染脂滴与对照组相比明显增多；CLA使HepG2细胞培养液中游离脂肪酸降低，50μmol·L-1组的培养液中游离脂肪酸与对照组相比含量降低了50%（P< 0.05）；CLA增加HepG2细胞ACC mRNA的表达，ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而增高。结论 CLA可增加HepG2细胞的脂肪沉积；其机制可能与CLA能够改变肝细胞中ACC的表达有关。【关键词】共轭亚油酸 (CLA) HepG2细胞 脂肪代谢 ACC
共轭亚油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一组具有共轭不饱和双键的亚油酸的异构体构成的混合物。1987年Michael Pariza研究小组分离出CLA，能够抑制化学诱导的皮肤肿瘤形成[1]。CLA有减轻肥胖、抗肿瘤、防止动脉粥样硬化、提高机体免疫力、增加骨密度、促进生长等多种生理功能。但是一些研究发现，CLA在减少体内脂肪的同时，可能出现肝脏脂肪代谢障碍，出现肝脏脂肪沉积的现象，其确切的分子机制尚不明确[2]。本实验就是研究CLA对肝脏细胞脂肪堆积的影响。
1 材料
1.1 HepG2细胞
第四军医大学营养与食品卫生学教研室惠赠。
1.2 主要试剂
高糖DMEM培养基，Gibco公司；新生小牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，Wolsen公司，四甲基偶氮噻唑兰(MTT)，Amresco公司；油红O-0625，Sigma公司，共轭亚油酸（CLA），Sigma公司；游离脂肪酸测试盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen公司；反转录试剂盒Fermentas公司葡萄糖试剂盒，上海复星公司。
1.3 主要仪器与设备
NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差显微镜，YI-875SA医用超净工作台，酶联免疫检测仪，MyCycler thermal cycle，凝胶成像仪等。
1.4 引物
引物由奥达公司合成，其中ACC引物为：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’- TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。
β-ACTIN引物为：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。
2 实验方法
2.1 细胞培养
HepG2细胞置于含10％新生小牛血清的高糖DMEM培养液中，含有100 IU/ml 青霉素，100μg/ml链霉素，37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温孵箱条件下培养，用胰蛋白酶消化液消化。
2.2 油红O染色观察HepG2细胞脂质沉积
将HepG2细胞接种于放有干净盖玻片的6孔板内，37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，加入不同浓度CLA作用24小时后，终止培养；弃培养液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室温孵育5分钟。除去甲醛溶液，加入同等体积的10%甲醛室温孵育1小时，用锡纸包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的异丙醇冲洗，完全干燥；加入油红O工作液放置10分钟，除去油红O立即用蒸馏水冲洗4次，晾干后在倒置显微镜下观察。
2.3 染色法测定培养液中的游离脂肪酸
将HepG2细胞以每孔5×104个细胞接种于24孔培养板内，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。待细胞长至80%满时，吸弃培养液，将实验组分为1%血清的DMEM培养液空白对照组（无细胞），正常细胞对照组（含1%血清的DMEM培养液）、CLA干预组(浓度为0、10、50、100μmol·L-1)，每组设3孔并列，孵箱中培养24小时后吸弃培养液，CLA干预组每孔加入1ml 100nmol·L-1的胰岛素溶液作用1小时后，按照试剂盒说明书方法，采用比色法测定培养液中游离脂肪酸的变化，同时24孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数。
2.4 胞总RNA的提取
用TRIZOL试剂按操作说明书提取，提取的RNA用约25μL DEPC 处理水溶解。
2.5 RNA纯度鉴定
取RNA5μL，稀释100倍后用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值，并计算OD260/OD280值及RNA浓度。
2.6 cDNA的合成
（1）以提取的总RNA3μg为模板，cDNA合成反应体系为12μL，包括：提取的总RNA模板3μg，Primer Oligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水补至12μL。3-5sec离心混匀，65℃加热5min后置于冰浴中。
（2）逆转录反应 反应体系包括：5×RTbuffer 4μL；RNase Inhibitor 1μL；10mMdNTPmix 2μL；Rever Tra Ace 1μL；补水到20μL。3-5sec离心混匀，37℃孵育5min后冰浴。
（3）加入M-MuLV反转录酶1μL，总体积为20μL。离心混匀，3-5s，42℃孵育60min。
（4）70℃加热10min以终止反应。合成的cDNA保存于-20℃或用于扩增。
2.7 PCR反应体系
10×Reaction Buffer 5μL；10mM dNTPs 1μL；Primer1(P1)和 Primer2(P2) 各20pmol；cDNA 2μL；KOD-Plus 1μL； H2O 33μL，总体积为50μL。
PCR扩增条件为: 解链95℃，60s；聚合55℃，60s；延伸72℃，45s，共30个循环。
2.8 琼脂糖凝胶电泳及图像处理
取各组肝细胞RT-PCR产物10μL及DNAMarker（TAKARA），在1%琼脂糖中进行凝胶电泳，电泳结果用GeneFlash成像系统（SynGene，USA）采集染色条带后转入计算机，并用GeneSnap图像分析软件分析各条带。结果以图像扫描的像素值表示。
2.9 统计学处理
实验数据用x-±s表示，组间差异比较用SPSS11.0统计软件进行方差分析，以P＜0.05为显著性差异水准。
3 实验结果
实验结果一
3.1 CLA对HepG2细胞脂质沉积的影响
如图1所示，与对照组相比较，CLA作用24小时后50μmol·L-1和100μmol·L-1 CLA组细胞中红染脂滴明显增多。提示肝细胞脂质沉积可能随着CLA作用浓度提高而增加。
图1 CLA作用后HepG2肝细胞中脂质沉积。油红O染色，倒置显微镜观察。(×200)
(a：正常细胞；b：正常细胞+胰岛素；c：10μmol·L-1 CLA；d：50μmol·L-1CLA；e：100μmol·L-1 CLA）
3.2 CLA对HepG2细胞培养液中游离脂肪酸含量的影响
由表1可见，不同浓度CLA干预HepG2细胞24小时，胰岛素溶液干预1小时后，与0μmol·L-1 CLA相比，50μmol·L-1、100μmol·L-1 CLA组的培养液中游离脂肪酸的含量分别降低了25%、50%，有显著性差异（P<0.05），提示CLA干预可能促进了细胞对培养液中游离脂肪酸的吸收。DMEM培养液对照组为无细胞空白对照组。
表1 CLA对HepG2细胞对培养液中游离脂肪酸的影响 (x-±s)
实验结果二
3.1 CLA作用增加ACC mRNA表达
从图2可以看出，与对照组相比，ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而逐渐增高。相对于胰岛素单独作用组，50 μmol·L-1 CLA+胰岛素组和100 μmol·L-1 CLA，ACC的mRNA表达水平增高明显，分别增加了1.38倍、1.43倍（n = 5，P<0.05），而10μmol·L-1 CLA。同时胰岛素单独作用组与对照组相比增加了2.26倍（n=5，P<0.05）。提示胰岛素单独作用可以增加ACC mRNA的表达，而CLA作用可以促进ACC mRNA的表达进一步升高，并具有浓度依赖效应。
图2：RT-PCR方法检测CLA作用后肝细胞中ACC mRAN的表达
(1:正常细胞;2:正常细胞+胰岛素;3:10μmol·L-1 CLA：50μmol.L-1 CLA；5：100μmol.L-1 CLA）
注：*与对照组比较 P<0.05；#与胰岛素组比较 P<0.05
4 讨论
CLA的作用可以减少机体肌肉组织脂肪蓄积，其通过增加机体线粒体中脂肪酸β-氧化过程而影响机体内脂质的沉积，脂肪酸β-氧化中的关键酶肉毒碱棕榈酰基转移酶1（carnitine palmitoyl-CoA transferase 1，CPT1）在CLA作用下明显增加，导致肌肉组织中脂肪氧化分解代谢增强，脂肪蓄积减少。有结果显示，CLA作用肝脏导致脂肪堆积，可能是由于脂肪合成增多而分解代谢减少引起的，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是肝脏脂肪合成中的关键酶，是长链脂肪酸的生物合成中限速酶，主要调节脂肪酸的合成，ACC催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A，是脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物[3]，调控骨骼肌心脏和肝脏中脂肪酸的氧化[4]。因此推测CLA致使肝脏中脂肪沉积可能是增加ACC增多，脂肪合成增多，同时增加丙二酰CoA，从而抑制了线粒体CPT1的活性及脂肪酸β-氧化过程，脂肪分解减少导致脂肪在肝细胞蓄积。
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在脂肪酸的代谢过程中起着重要作用。ACC包括乙酰辅酶A 羧化酶1- ACC1（ACCα）和乙酰辅酶A 羧化酶2- ACC2（ACCβ）两种形式，被不同的基因编码。ACCβ主要在β-氧化作为主要能量来源的骨骼肌和心脏中表达[5]。ACC活性受到别构效应物和磷酸化的调节[6]。
实验中通过检测细胞内ACCmRNA的表达，发现随着CLA的剂量增高，ACCmRNA表达逐步增高，ACC表达增高，进一步导致丙二酰CoA增加，细胞内CPT1的活性受到抑制，细胞脂肪合成增加而分解减少，CLA干预后的培养液中游离脂肪酸减少，提示更多的脂肪酸满足细胞脂肪合成的需要，同时脂肪分解减少，引起肝脏脂肪沉积。但其机制还不甚明确，需要进一步实验证实。
参 考 文 献
[1]Pariza MW，Ashoor SH，Chu FS，Lund DB: Effects of temperature and time on mutagen formation in pan-fried hamburger. Cancer Lett 1979，7:63-69.
[2]Takahashi Y，Kushiro M，Shinohara K， Ide T: Activity and mRNA levels of enzymes involved in hepatic fatty acid synthesis and oxidation in mice fed conjugated linoleic acid. Biochim Biophys Acta 2003， 1631:265-273.
[3]Ha YL，Grimm NK，Pariza MW: Anticarcinogens from fried ground beef: heat-altered derivatives of linoleic acid. Carcinogenesis 1987，8:1881-1887.
[4]Degrace P，Demizieux L，Gresti J，Chardigny JM，Sebedio JL，Clouet P: Hepatic steatosis is not due to impaired fatty acid oxidation capacities in C57BL/6J mice fed the conjugated trans-10，cis-12-isomer of linoleic acid. J Nutr 2004，134:861-867.
[5]McGarry JD，Foster DW: Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980，49:395-420.
[6]Tong L: Acetyl-coenzyme A carboxylase: crucial metabolic enzyme and attractive target for drug discovery. Cell Mol Life Sci 2005，62:1784-1803.
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